过氧化物歧化酶基因定位(过氧化物歧化酶)
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1、SOD(超氧化物歧化酶)是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
2、对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。
3、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD)是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起,人们对SOD的研究己有七十多年的历史。
4、1969年McCord等重新发现这种蛋白,并且发现了它们的生物活性,弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质,所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
5、 它催化如下的反应:202+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基,是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。
6、它是活性氧的一种,具有极强的氧化能力,是生物氧毒害的重要因素之一。
7、 SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子,它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。
8、尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧,但体内 6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。
9、这样,三种酶便组成了一个完整的防氧链条。
10、 提取`提纯的方法: 本实验涉及一种从生物体内提取超氧化物歧化酶的工艺制备方法。
11、该方法的制备步骤为:将活蚯蚓洗净,湿磨,得到的蚓汁经过冷冻、在缓冲液中匀浆、搅拌,离心,弃沉淀物得清液;上述清液进行加热,冷却,过滤后滤液中加入丙酮,沉淀物用缓冲液溶解,弃沉淀物得上清液;上清液在搅拌下加入mg、Cu、Zn,然后离心,弃去沉淀,向上清液中加入硫酸铵溶液,离心收集沉淀;将上述沉淀溶解在缓冲液中,接着透析至无SO2-4,透析液最后上层析柱收集洗脱液,浓缩、冷却、干燥,即得蓝绿色的Cu、ZnSOD。
12、 检验与纯度分析: 在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
13、本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
14、 邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2 -,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
15、这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30~45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
16、当有SOD存在时,由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性。
17、 酶活力单位定义:在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
18、 试剂 (1)pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 称取Tris 0.61g,EDTA-2Na 0.037g,用双蒸水溶解至80mL左右,用HCl调节pH =8.20(用pH计校正),最后定容至100mL。
19、 (2)10mmol/L HCl (3)50 mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.063g,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL,避光保存。
20、 (4)SOD样液 2、器材 (1)恒温水浴槽 (2)紫外分光光度计 (3)试管、刻度吸管、微量注射器 [方法和步骤] 邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚(空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ),迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值的变化。
21、要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07(可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值)。
22、 2、SOD样液的活性测定 样品管取代自氧化管。
23、样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚。
24、其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
25、 (3)计算 。
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