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构建质粒载体的基本流程(分子克隆)

导读 大家好,我是小东,我来为大家解答以上问题。构建质粒载体的基本流程,分子克隆很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧!1、载体 所谓载...

大家好,我是小东,我来为大家解答以上问题。构建质粒载体的基本流程,分子克隆很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧!

1、载体 所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

2、 基因库的建造 特异基因的筛选 核酸序列测定  一、基因克隆的基本方法   一个典型的基因克隆实验,主要有以下操作和结果:   (1)包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子(克隆载体,通常是环状的),形成重组DNA分子。

3、   (2)重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。

4、大肠杆菌是使用较多的受体细胞。

5、   (3)在受体细胞中,克隆载体指导重组DNA分子复制,产生许多完全相同的拷贝。

6、   (4)当受体细胞分裂时,重组DNA分子的拷贝进入子细胞,克隆载体的复制将在子细胞中继续。

7、   (5)大量分裂的受体细胞形成克隆:一个细胞群体,其中每个细胞都含有许多重组DNA分子的拷贝。

8、   显而易见,基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。

9、它之所以具有非常重要的生物学意义,是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。

10、通常,一个基因总是和细胞里其他基因同在。

11、基因克隆技术诞生之前,我们根本无法纯化单个基因,这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发利用。

12、   1、重组DNA分子的构建   构建重组DNA分子是基因克隆实验的第一步,亦即,把环状的载体在指定部位切断,然后把含目的基因的DNA分子插入其中,再将两者连接起来。

13、这一过程需要两种DNA操作酶:限制性内切酶(restriction endonucleases)和连接酶(ligases)。

14、   限制性内切酶能够识别DNA分子上的特定核苷酸序列,并在该处特异性切断DNA分子。

15、例如,PvuI(细菌Proteus vulgaris分离)只识别和切断6核苷酸序列CGATCG;从相同细菌分离的PvuII,却只识别并切断CAGCTG。

16、许多限制性内切酶的识别位点是6个核苷酸,但是,也有识别4个或5个、甚至8个核苷酸顺序的限制性内切酶。

17、此外,有些限制性内切酶的识别顺序可能不是唯一的,例如,HinfI可以识别并切断GAATC、GATTC,GAGTC和GACTC。

18、因此,通常也将HinfI的识别位点记为GANTC,N代表A、T、G和C中的任意一种核苷酸。

19、   经限制性内切酶处理后的DNA分子断端有两种:平端和粘端,它们的性质对基因克隆的实验设计有重要影响。

20、其中,具有不同识别位点的限制性内切酶可以产生相同的粘端。

21、例如,BglII(AGATCT)和BamHI(GGATCC)产生与Sau3A相同的GATC粘端。

22、显然,经上述三种酶处理的DNA分子片断之间均可以在相应的断端形成互补双链。

23、   DNA分子片断通过粘端形成的碱基互补并不能使之相互连接,后一过程需要连接酶的催化作用。

24、所有生物细胞中都产生连接酶,但是,基因克隆中最常用的是T4噬菌体的连接酶。

25、连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。

26、由于平端不能使DNA片断保持相互接近的位置,因而,和粘端相比,连接酶对平端DNA分子之间连接反应的催化效率较差。

27、   2、克隆载体及其主要功能。

本文到此讲解完毕了,希望对大家有帮助。

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